软骨细胞造就指南
20世纪60年代起人们对软骨组织的钻研进入到细胞水平。
1967 年 ManningWK 等使用胰蛋白酶结合细菌胶原酶消化分离与造就人软骨细胞得到成功。
目前人软骨细胞体外分离与造就的步骤已被宽泛利用于软骨细胞生物学钻研 ，，为骸骨软化症、骨关节炎( osteoarthritis ，， OA )等疾病的防治及组织工程技术修复软骨缺损等钻研提供了重要的步骤学参考。
人软骨细胞特点
幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层 ，，单个散布 ，，体积较小 ，，呈椭圆形 ，，长轴与软骨理论平行 ，，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形 ，，细胞核圆形或卵圆形 ，，染色浅 ，，细胞质弱嗜碱性 ，，常见数量不一的脂滴。
成熟的软骨细胞多2~8个成群散布于软骨陷窝内 ，，这些软骨细胞由统一个母细胞割裂增殖而成 ，，称为同源细胞群。电镜下 ，，软骨细胞有突起和皱褶 ，，细胞质内有大量的粗面内质网和蓬勃的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中 ，，软骨细胞收缩为不规定形 ，，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。
软骨细胞造就及传代
图A为原代细胞分离造就软骨细胞贴壁后的状态 ，，细胞呈多角型 ，，扁平状 ，，胞质丰硕 ，，可见清澈、圆形的细胞核 ，，部门区软骨细胞集落样成长。
图B为软骨细胞传代造就后的状态 ，，细胞似椭圆形 ，，细胞胞浆丰硕。
随传代次数不休增长 ，，软骨细胞集落中的梭形细胞数量逐步增多。
为什么一传代就变形？？
在体外造就人软骨细胞时 ，，随着传代次数增长软骨标志性蛋白Ⅱ胶原合成排泄削减 ，，而Ⅰ、Ⅲ型胶原合成排泄增多。
Ⅱ胶原的合成和排泄是维持软骨细胞分化表型的特点性指标 ，，提供了软骨特有的张力和硬度。
软骨中的其他分子与胶原蛋白结合形成网状结构 ，，支持软骨拥有肯定的弹性 ，，对于软骨维持状态及承载外来负荷起着极度重要的作用。
所以 ，，随着传代次数的增长 ，，维持细胞状态的物质会逐步削减 ，，细胞的状态就会产生扭转。
这种状态和职能的变动称之为反分化景象 ，，也是单层传代细胞的普遍景象。
软骨细胞传代步骤
1. 低密度造就的软骨细胞易产生去分化景象 ，，通常最适接种密度为2~10×10^4/cm2;
2. 软骨细胞代谢较为缓慢 ，，无需增长换液频度 ，，可能粉碎由细胞排泄而形成的群体化学环境。
传代步骤
若是细胞密度达80%-90% ，，即可进行传代造就。
1. 弃去造就上清 ，，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于造就瓶中 ，，置于37℃造就箱中消化1-2分钟 ，，而后在显微镜下观察细胞消化情况 ，，若细胞大部门变圆并脱落 ，，迅速拿回操作台 ，，轻敲几下造就瓶后加少量造就基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加造就基 ，，轻轻打匀后吸出 ，，在1000RPM前提下离心4分钟 ，，弃去上清液 ，，补加1-2mL造就液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：：2到1：：5的比例分到新的含8ml造就基的新皿中或者瓶中。
